共聚焦顯微鏡（CLSM）具有成像分辨率高、Z軸深度分辨率高這兩個(gè)特點(diǎn)[1]。這意味著使用共聚焦顯微鏡可以對(duì)某一區(qū)域的生物組織樣本進(jìn)行圖像顯示，并通過不斷調(diào)節(jié)Z軸深度，對(duì)一定Z軸深度范圍內(nèi)的生物組織進(jìn)行成像，并通過疊加各個(gè)深度的二位成像，得到該區(qū)域生物組織的三維圖像重構(gòu)圖。是經(jīng)過了很多年的發(fā)展才實(shí)現(xiàn)了完成顯微鏡所需的激光束掃描。經(jīng)過不斷地發(fā)展，最終實(shí)現(xiàn)了使用聚焦激光束對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描，完成二維圖像重構(gòu)，再到后期的三維成像。

傳統(tǒng)顯微鏡進(jìn)行成像時(shí)深度分辨率較差，而使用共聚焦顯微鏡可以對(duì)樣品某一層進(jìn)行成像，具有較高的深度分辨率，進(jìn)而可以對(duì)樣本進(jìn)行三維成像。

工作原理1：

使用激光器發(fā)射出一束激光作為光源，輸出的激光通過一個(gè)物鏡聚焦在樣品表面。通過改變激光束聚焦在樣品的位置，實(shí)現(xiàn)激光聚焦點(diǎn)在樣品一片區(qū)域內(nèi)的掃描。產(chǎn)生的熒光信號(hào)經(jīng)過一個(gè)小孔后，被光電探測(cè)器收集，小孔與焦平面處樣本成共軛關(guān)系，離焦熒光信號(hào)被濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定層析能力。采集激光束掃描至每一點(diǎn)時(shí)激勵(lì)光與樣本反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，經(jīng)過圖像重構(gòu)得到該片樣本區(qū)域的熒光成像。

工作原理2：

經(jīng)過光強(qiáng)調(diào)節(jié)后的激勵(lì)光進(jìn)入一個(gè)由兩個(gè)可快速精密調(diào)節(jié)角度反射鏡組成的XY反射鏡組。兩個(gè)反射鏡分別對(duì)應(yīng)X軸Y軸方向，通過調(diào)節(jié)兩個(gè)反射角度，使得經(jīng)過XY反射鏡組的出射激勵(lì)光在一定面積的平面范圍內(nèi)按一定軌跡進(jìn)行掃描。常見的掃描軌跡有柵格形（Raster）掃描軌跡、螺旋形（Spiral）掃描軌跡。

掃描過程中的入射激勵(lì)光會(huì)與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，一部分熒光會(huì)沿與入射激勵(lì)光相反的方向在先后通過物鏡和XY反射鏡組后進(jìn)入二向色鏡（Beam Splitter）中，分光鏡會(huì)反射激勵(lì)光，同時(shí)不會(huì)反射信號(hào)光，起到分離激勵(lì)光與熒光的作用。

經(jīng)過分光鏡后的熒光進(jìn)入到物鏡中再次被匯聚成為焦點(diǎn)，并在這個(gè)熒光焦點(diǎn)處加入針孔（Pinhole），此熒光焦點(diǎn)與樣本處焦點(diǎn)具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，樣本焦平面以外產(chǎn)生的熒光信號(hào)在經(jīng)過針孔時(shí)會(huì)被遮擋住，因此僅有樣本焦平面產(chǎn)生的熒光信號(hào)會(huì)通過針孔，針孔起到濾波作用，使得共聚焦顯微鏡具有深度辨析能力。

經(jīng)過針孔后的熒光信號(hào)具有較強(qiáng)的層析能力，同時(shí)由于光強(qiáng)較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測(cè)器進(jìn)行探測(cè)。在此一般使用光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）將熒光信號(hào)放大并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，此電信號(hào)為模擬信號(hào)。光電倍增管可以在不引入噪聲的情況下將微弱的光信號(hào)放大約一百萬倍。光電探測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度與輸入熒光強(qiáng)度成正比。經(jīng)光電倍增管轉(zhuǎn)換成，與熒光強(qiáng)度成正比的電信號(hào)隨后由模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，此數(shù)字信號(hào)對(duì)應(yīng)樣本焦點(diǎn)處熒光信號(hào)強(qiáng)度。隨XY反射鏡組掃描，通過探測(cè)特定深度樣本區(qū)域內(nèi)的熒光信號(hào)，得到每一點(diǎn)熒光強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的數(shù)字信號(hào)值，經(jīng)過計(jì)算機(jī)圖像處理將每一個(gè)數(shù)字信號(hào)值轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的灰度值，每一灰度信號(hào)值對(duì)應(yīng)一個(gè)像素點(diǎn)，將每個(gè)灰度信號(hào)與激勵(lì)光掃描軌跡相對(duì)應(yīng)得到成像圖。

共聚焦顯微鏡特點(diǎn)

共聚焦激光掃描顯微鏡通過引入小孔，使得顯微鏡具有深度分辨率，成像質(zhì)量增加。并且通過對(duì)體樣本進(jìn)行斷層步進(jìn)成像，通過后期圖像處理可以得到體樣本三維立體成像。

因?yàn)楣簿劢癸@微鏡為點(diǎn)掃描成像，所以其成像速度相對(duì)較慢。

共聚焦顯微鏡應(yīng)用

為使用共聚焦顯微鏡對(duì)葵花花粉進(jìn)行5微米步進(jìn)斷層成像示意圖，激勵(lì)光為488nm（綠）和543nm（紅）雙波長(zhǎng)配合激勵(lì)，所得成像分辨率為3微米。通過將圖 4中每一層的成像按順序重組，可以得到如圖 5所示的葵花花粉三維成像圖。